Le biotecnologie usano organismi viventi o loro parti per produrre beni e servizi.
• Biotecnologie tradizionali: sfruttano processi naturali senza modificare il DNA.
Esempi: pane, birra, vino.
• Biotecnologie innovative: modificano il DNA tramite tecnologia del DNA ricombinante per ottenere nuove funzioni.
Esempi: insulina ricombinante, terapia genica.
PCR (Reazione a Catena della Polimerasi)
La PCR, inventata da Kary Mullis nel 1983, è una tecnica che amplifica una specifica sequenza di DNA, producendo molte copie da un campione minimo.
Componenti principali
- DNA stampo
- Primer
- Taq polimerasi
- Nucleotidi (A, T, C, G)
- Buffer e magnesio
Fasi della PCR - Denaturazione (~95°C): separazione dei due filamenti di DNA.
- Annealing (~50-65°C): i primer si legano al DNA.
- Estensione (~72°C): la Taq polimerasi sintetizza nuovi filamenti.
Il ciclo si ripete 25-35 volte, raddoppiando il DNA a ogni ciclo.
Elettroforesi su gel
Serve per visualizzare e separare i frammenti di DNA ottenuti dalla PCR.
• Il DNA, carico negativamente, migra verso il polo positivo.
• I frammenti piccoli scorrono più velocemente di quelli grandi.
• Le bande vengono rese visibili con coloranti fluorescenti e confrontate con un marker di riferimento.
Applicazioni
• Diagnosi mediche: identificazione di virus, batteri e mutazioni genetiche.
• Indagini forensi: analisi del DNA per identificare persone.
• Ricerca genetica: studio dei geni, OGM e produzione di farmaci.
CRISPR-Cas9
Questo complesso è stato scoperto da due scienziate, Emmanuelle Charpentier e Jennifer A. Doudna (vinsero per questo il Nobel per la chimica nel 2020), nei batteri come sistema immunitario adattivo contro i virus batteriofagi. Alla base di questo complesso c’è il CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), locus batterico caratterizzato da una sequenza ripetuta ad intervalli regolari (parti del genoma batterico chiamate “Repeat”) e da interruzioni regolari (parti del DNA di virus già incontrati ed inglobati in precedenza definite “Spacer”).
Mentre la Cas9 è la vera e propria proteina che permette la rottura del DNA virale di fagi già incontrati in precedenza
Una volta inglobato il DNA di un virus nel CRISPR il batterio e tutta la prole (il CRISPR è infatti ereditario) sarà immune a quel virus.
La rottura del DNA virale
La Cas9 viene rilasciata assieme ad un RNA guida (gRNA) che è complementare al DNA virale presente nel genoma batterico e si può quindi legare al virus vero e proprio e tramite la Cas9 (un’endonucleasi in grado di rompere i legami fosfodiestere) taglia il DNA del virus “uccidendolo”
Il genoma batterico viene preservato
Nel genoma batterico manca una sequenza che viene definita PAM(che può essere AGG, TGG, CGG o GGG), che agisce da “conferma” per tagliare il DNA. Quest’ultima si trova dopo la fine della sequenza da tagliare esclusivamente nei virus impedendo l’autodistruzione del batterio.
Cas9 in ambienti artificiali
Per sfruttare la proteina Cas9 al di fuori dei batteri e quindi negli eucarioti c’è bisogno di apportare alcune modifiche:
I due pezzi che formano il gRNA vengono uniti a formare un sgRNA (single guide RNA);
Alla Cas9 (abituata al filamento di DNA dei batteri che non hanno nucleo) dev’essere aggiunta una porzione di amminoacidi (Nuclear localization signal protein) per renderla capace di entrare nel nucleo della cellula ed interagire con il DNA cellulare.
Delivery della Cas9 nella cellula
Ci sono diversi metodi per inserire la Cas9 all’interno di una cellula:
- Iniezione della Cas9+gRNA nella cellula bersaglio
- Iniezione DNA (sotto forma di plasmide) nella cellula bersaglio
- Utilizzare una cellula transgenica in grado di produrre Cas9+gRNA
Ma la cellula rigetta l’alterazione e cerca di riportare il pezzo di DNA rimosso al suo posto portando ad errori e mutazioni genetiche.
Per risolvere questa problematica si aggiunge un filamento di DNA stampo del gene modificato per aiutare la trascrizione del nuovo filamento
Possibilità attuali e future
Ad oggi sono state scoperte diverse applicazioni per la Cas9, come ad esempio:
- Ricerca genetica più complessa grazie a metodi più semplici e veloci
- “Risuscitare specie estinte” tramite il loro DNA preservato nel tempo
- Strategie di controllo per quanto riguarda animali come gli insetti (gene drive)
- Produrre varietà vegetali immuni a specifici parassiti
- Curare malattie genetiche
- In futuro “creare” nuove specie animali e/o vegetali.
Tuttavia esiste un limite etico all’utilizzo di questa tecnica: si può alterare solo la linea somatica negli esseri umani e non quella germinale.
Esperimenti e ricerche condotte
Diversi esperimenti sono stati portati avanti per perfezionare le tecniche di gene editing, ad esempio sulla drosofila (moscerino della frutta) sfruttando l’eredità super-mendeliana ed il gene drive (rendere la percentuale di un fenotipo dominante come il sesso maschile della mosca da 50% al 100% della prole).
Anche in Italia abbiamo degli importanti ricercatori che lavorano a questa tecnica tanto complessa quanto utile, tra cui il professore Giuseppe Saccone. Grazie ad un corso limitato a studenti interessati ad argomenti di biologia ho avuto la possibilità di incontrare il professore Saccone nel suo laboratorio all’Università degli Studi di Napoli Federico II, dove studiano la mosca mediterranea proprio come sono stati effettuati esperimenti e ricerche sulla drosofila. Un ambiente fortemente stimolante, dove dottorandi e professori collaboravano per studiare la genetica di queste mosche, di zanzare tigre e dove veniva sfruttata la CRISPR-Cas9 per modificare i geni a proprio piacere. Ciò che mi ha colpito molto oltre all’atmosfera da laboratorio di ricerca (vetta a cui punto nel mondo della chimica) è stato come due insetti apparentemente uguali (drosofila e mosca mediterranea) avessero cicli di vita ben distinti, elementi genetici completamente diversi e metodologie di allevamento complesse e precise.
La CRISPR-Cas9 non è ancora usata sugli esseri umani per via della sua scoperta relativamente recente, motivo di incertezze e imprecisioni, ma grazie alle ricerche di scienziati da tutto il mondo verrà sfruttata per fare grandissime cose.